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活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的核心是通過對活細胞中的部分細胞質(zhì)進行微創(chuàng)提取，并對極其微量的細胞質(zhì)RNA進行擴增，實現(xiàn)在進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序后，依舊保持細胞的存活和功能，從而可以跟蹤細胞的動態(tài)變化。

細胞是生命的基本單位，了解它的過去、現(xiàn)在和未來不僅有助于我們了解正常的發(fā)育過程，也對理解疾病的產(chǎn)生和發(fā)展至關(guān)重要。然而，想要看清細胞的“前世今生”仍然面臨很大的技術(shù)困難。

(資料圖片僅供參考)

8月17日，中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所研究員陳萬澤以共同第一作者身份在國際頂級期刊《自然》雜志上發(fā)表長文，介紹了他們研究團隊在國際首創(chuàng)的活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（Live-seq），該技術(shù)首次讓單細胞進行轉(zhuǎn)錄測序后，依然能保持細胞存活，首次實現(xiàn)了活細胞全基因表達的連續(xù)觀測。

“該研究實現(xiàn)了使用活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對同一個活細胞多次分離部分細胞質(zhì)進行多次轉(zhuǎn)錄組測序，表明這一技術(shù)有望在將來用于構(gòu)建單個活細胞的轉(zhuǎn)錄組系列變化動態(tài)模型。該研究為單細胞轉(zhuǎn)錄組測序提供了全新的研究策略，為我們理解生命過程的動態(tài)變化提供了強有力的手段，是這一領(lǐng)域的又一重大突破。” 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授湯富酬評論道。

不殺死細胞就能進行測序

為什么人類體內(nèi)的細胞擁有的基因組幾乎一樣，但是每個人卻各不相同呢？基因組中數(shù)萬個基因表達與否和表達程度高低，很大程度上決定了細胞的種類和功能。

因此，如果知道細胞不同時間的基因表達的變化，就能夠了解細胞的過去、現(xiàn)在和未來。

當(dāng)前，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是了解細胞狀態(tài)的重要手段，通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序能夠看清細胞現(xiàn)在所有基因的表達狀態(tài)。但是該技術(shù)在理解細胞的動態(tài)變化方面卻面臨很大挑戰(zhàn)。

“利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)來觀測細胞狀態(tài)的前提，是需要將細胞裂解，提取其中的RNA來測定每個基因表達量的高低，但這樣就不可避免地殺死了細胞。”陳萬澤說道，“使用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，也只能了解到一個細胞當(dāng)下的狀態(tài)，卻不能了解它的過去，也無法知曉它將來的功能。”

通過近7年的努力，陳萬澤與合作者開發(fā)了活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，其核心是通過對活細胞中的部分細胞質(zhì)進行微創(chuàng)提取，并對極其微量的細胞質(zhì)RNA進行擴增，實現(xiàn)在進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序后，依舊保持細胞的存活和功能，從而可以跟蹤細胞的動態(tài)變化。

論文通訊作者、瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院教授巴特·普朗克（Bart Deplancke）表示，該技術(shù)兼具全基因表達分辨率和動態(tài)解析能力，是目前對單細胞轉(zhuǎn)錄組直接動態(tài)測量、偶聯(lián)細胞現(xiàn)有狀態(tài)和其后續(xù)表型的唯一解決方案。

歷經(jīng)兩次碰壁終于“吸”出RNA

如何在不殺死細胞的前提下，看到細胞的動態(tài)變化？

“我們首先想到的是外泌體，它是細胞向外面吐出來的小泡，里面有蛋白質(zhì)、RNA等物質(zhì)。如果我們把單個細胞的外泌體都收集起來，再對其中的RNA進行測量，或許就可以在一定程度上反映細胞狀態(tài)而又不殺死細胞。”陳萬澤說道。

單個細胞中僅有10皮克的RNA，這相當(dāng)于一克的一千億分之一的重量，而細胞分泌的外泌體中的RNA更是少之又少。研究團隊設(shè)計了一種微流控技術(shù)用以完成單細胞捕獲、外泌體收集等，但他們發(fā)現(xiàn)由于外泌體中的RNA數(shù)量太少，根本無法實現(xiàn)單細胞分子水平的觀測。

隨后，陳萬澤嘗試利用在生命科學(xué)領(lǐng)域非常小眾的原子力顯微鏡來獲取細胞中的RNA。它有一個很尖的硅探針，多用來檢測物質(zhì)表面性質(zhì)。研究團隊通過對探針進行表面活化、修飾、洗脫等改造，讓其能夠把細胞中的RNA“釣”出來。

“這種探針很細，對細胞的損傷很小，就像魚鉤一樣，改造后可以把細胞中的RNA‘釣’出來，并能保證細胞繼續(xù)存活。我們改造了數(shù)十個探針后，結(jié)果只在兩個細胞上成功‘釣’到了RNA。”陳萬澤回憶道，當(dāng)時購買一個原子力顯微鏡探針需要800美元，研究成本太高，成功率太低，這種情況讓這項研究再次面臨阻礙。

在一次偶然的學(xué)術(shù)交流中，陳萬澤與導(dǎo)師了解到，瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的朱麗亞·沃爾特（Julia Vorholt）實驗室開發(fā)了一種特殊的原子力顯微鏡，能夠吸出一部分細胞質(zhì)。

一番交流后，陳萬澤團隊與朱麗亞·沃爾特實驗室一拍即合，展開了聯(lián)合攻關(guān)。聯(lián)合團隊對一系列的實驗過程進行了優(yōu)化，解決了RNA降解、低溫下的快速操作、超微量樣品轉(zhuǎn)移、采樣通道清洗避免交叉污染、圖像下追蹤細胞等多個問題，保證了實驗結(jié)果的可靠性。

聯(lián)合團隊利用重新改造后的活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對5種類型共295個細胞進行了測序，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能夠有效區(qū)分不同類型的細胞，且平均每個細胞能檢測到約4112個基因的表達信息。

僅對少量的細胞質(zhì)進行測序，是否就能代表細胞的狀態(tài)？

“我們平行比較了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)活細胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與普通的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果高度吻合，證明活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠很好地體現(xiàn)細胞的全轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)。”陳萬澤說道。

細胞的存活率又如何保證呢？

“這種特殊的原子力顯微鏡探針尖端只有幾百個納米大小，對細胞損傷極小。吸取約5%—50%的細胞質(zhì)后，細胞體積可以快速恢復(fù)到正常水平，存活率為85%—89%，細胞能進行正常分裂。通過一系列的功能分析和分子表征，我們沒有發(fā)現(xiàn)活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對細胞的狀態(tài)有顯著的影響。”陳萬澤表示。

對此，審稿人在評審意見中也寫道：“由于細胞測序后仍舊存活，活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)首次實現(xiàn)了對同一個細胞全基因表達的連續(xù)測量。”

細胞測序結(jié)果從“高清圖片”到“高清電影”

在細胞觀測技術(shù)史上，顯微成像和基因編輯介導(dǎo)的分子記錄等技術(shù)不僅能觀察細胞的生長、分裂、死亡等過程，還能觀測細胞中的單個或幾個基因指標(biāo)。

2009年，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)為更系統(tǒng)全面地定義細胞類型和狀態(tài)提供了變革性手段。但人們?nèi)匀恢荒苡^察到細胞的靜態(tài)狀態(tài)，無法連續(xù)觀測細胞的動態(tài)或者檢查細胞后續(xù)的表型。

如果將利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)觀測細胞，比喻為看一張細胞在分子水平的高清圖片，那么利用活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)觀測細胞，就好比看一部細胞的高清電影，能夠看見它的“前世今生”。

“活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以回答細胞怎樣的過去決定了它的現(xiàn)在，不僅知道細胞為何存在差異，還知道這些差異從何而來。”陳萬澤介紹。

在驗證實驗中，研究團隊利用活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)直接測定了同一個巨噬細胞在不同時間的狀態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)細胞起始狀態(tài)的少數(shù)基因的表達差異和噪音（如Nfkbia、Gsn等）是決定細胞后續(xù)反應(yīng)差異的重要原因。然而，普通的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)無法找到這些規(guī)律。

陳萬澤表示，盡管活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)仍然存在諸多挑戰(zhàn)，需要進一步完善，比如低通量、暫不能在體內(nèi)應(yīng)用、在高度極化且mRNA分布不均的細胞中無法實現(xiàn)全細胞轉(zhuǎn)錄組測序、對細胞更多次的采樣還需進一步研究等，但該技術(shù)首次實現(xiàn)了活細胞連續(xù)觀測，也為單細胞測序技術(shù)發(fā)展帶來了更多可能性。未來，團隊將進一步進行深入研究，提高活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的可用性。